Дезмонд Майлс (кодовое имя «Объект 17») — потомок Эцио и Альтаира. До шестнадцати лет учился умениям ассасина, но после сбежал. До похищения работниками «Абстерго» работал барменом и жил под фальшивыми именами, чтобы его труднее было отыскать. После побега с Люси согласился обучиться навыкам ассасинов, чтобы отомстить корпорации.
Люси Стиллман — агент ассасинов. Некоторое время работала в «Абстерго» над «Анимусом». Винит себя в смерти «Объекта 16».
Ребекка Крэйн — технический специалист ассасинов, создавшая новую, улучшенную версию «Анимуса».
Шон Гастингс — координатор, отвечающий за базы данных и снабжающий Дезмонда необходимой информацией.
Майкл (кодовое имя «Объект 16») — ассасин, его похитило Абcтерго ещё до Дезмонда. В Абстерго сделал много знаков с помощью крови, и в программу Анимуса тоже внёс знаки, чтобы Объект 17 (Дезмонд) разгадал тайну. Во 2ой части секрет был в видео про Адама и Еву, в Братстве Крови он сам появляется (точнее силуэт). Люси утверждает, что он умер, однако сам он говорит что ещё живой.
Уоррен Видик — тамплиер, сотрудник корпорации «Абстерго», под руководством которого Дезмонд реконструировал воспоминания Альтаира. В конце второй части игры отыскивает убежище ассасинов.

Исторические персонажи
Эцио Аудиторе — главный протагонист игры, сын флорентийского банкира Джованни Аудиторе. Как и его отец, он ассасин.
Леонардо да Винчи — учёный , художник, инженер. Помогает Эцио в его приключениях, в частности, расшифровывая страницы кодекса, конструирует оружие и даёт «попользоваться» летучей машиной.
Родриго Борджиа — глава итальянских тамплиеров, папа римский. Борджиа стремился соединить две частицы Эдема и объединить Италию под властью тамплиеров. Именно он виновен в смерти отца Эцио Джованни и его братьев Петруччо и Федерико. Родриго Борджиа является конечной целью Эцио и главным антагонистом игры.
Вьери Пацци — молодой дворянин, младший сын Франческо Пацци. Вьери склонен к расточительству и жестокости. Много раз пытался причинить вред семье Эцио. Даже его отец говорит о своем сыне как о непокорном и агрессивном человеке. Однако в своем письме к Франческо Пацци Фра Джокондо пишет, что Вьери просто необходима отцовская любовь и его еще вполне можно исправить.
Франческо Пацци — банкир, представитель флорентийской семьи Пацци. Являлся центральной фигурой заговора против Лоренцо Медичи.
Якопо Пацци — глава семьи Пацци и семейного банка. Многократно добивался суда над Лоренцо Медичи, однако против него у Якопо ничего не было, поэтому Пацци вступил в сговор с тамплиерами в надежде покончить с правлением Медичи во Флоренции.
Эмилио Барбариго — глава гильдии купцов, влиятельный человек в Венеции. Почти единолично финансировал венецианскую городскую стражу, установил монополию на рынке, что позволило ему быстро продвинуться по карьерной лестнице.
Марко Барбариго — дворянин, участник заговора против Джованни Мочениго. Имеет личного телохранителя Данте Моро, женат на его бывшей супруге. В результате интриг тамплиеров стал новым дожем.
Сильвио Барбариго — член Верховного трибунала Венеции, прокурор. Участник заговора против Джованни Мочениго. После гибели Марко Барбариго попытался бежать из Венеции.
Чекко Орси — профессиональный вор, брат Людовико Орси. По приказу Родриго Борджиа напал на Форли.
Федерико Аудиторе — дворянин, старший брат Эцио. Убит из-за предательства Уберто Альберти. Погиб вместе с Петруччо и Джованни Аудиторе..